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1924年，鲁迅在一篇短文中署名宴之敖者，他曾对许广平解释过此署名的含义：“宴从宀（mián，深网），从日，从女；敖从出，从放（《说文》作予予，从出从放）；我是被家里的日本女人逐出来的。”在两地书中，鲁迅也将羽太信子成为“宴太”。
1925年，周作人翻译了罗马诗人喀都路斯的第一百首诗《伤逝》，中有“兄弟，只嘱咐你一声珍重”之句。不久，鲁迅发表同名小说《伤逝》，开篇便说：“如果我能够，我要写下我的悔恨和悲哀，为子君，为自己。”晚年，周作人在《知堂回想录》中写道：“《伤逝》不是普通恋爱小说，乃是假借了男女的死亡来哀悼兄弟恩情的断绝的……我也痛惜这种断绝，可是有什么办法呢，人总只有人的力量。”
发表小说《伤逝》后两周，鲁迅又发表小说《弟兄》，此文完全是描写1917年周作人出疹子，自己惊慌失措、悉心照料之事。他在文中向弟弟表达了“鹡鸰在原”（鹡鸰亦作脊令，一种生活在水边的小鸟，当它困处高原时，就悲鸣向同伴求救，《诗经》中有云：“脊令在原，兄弟难急”）的意思。
鲁迅收藏的现代作家的译著中，以周作人的译著种类最多。二人失和后，鲁迅仍搜集弟弟的作品。
《语丝》被查封后，鲁迅担心周作人的安危，给川岛写信说：“他之在北，自不如来南之安全，但我对于此事，殊不敢赞一辞，因我觉八道湾之天威莫测，正不下于张作霖，倘一搭嘴，也许罪戾反而极重，好在他自有他之好友，当能相助耳。”
一次，周作人的一部译稿交给商务印书馆出版，鲁迅去时，编辑正在校勘，鲁迅说：“启孟的译稿编辑还用得着校吗？”在商务印书馆工作的周作人说：“那总还是要看一遍的吧！”鲁迅这才默不作声了。
1933年，鲁迅再次向弟弟发出求和的讯号，他在其诗《题三义塔》中写道：“度尽劫波兄弟在，相逢一笑泯恩仇。”
1936年10月，平津地区的104位教授联名发表《平津文化界对时局的意见书》，周作人没有参与此事。鲁迅逝世后，周建人给周作人写信说：“（鲁迅）又说到关于救国宣言这一类的事情，谓连钱玄同、顾颉刚一般人都具名，而看不到你的名字，他的意见，以为遇到此等重大问题时，亦不可过于退后云云。”
与鲁迅断交后，周作人依旧平静地上课、作文。但他在1923年7月25日所写的《自己的园地·旧序》中，重复了7月18日写给鲁迅字条中的话：“过去的蔷薇色的梦都是虚幻。”
1924年6月，周作人写《破脚骨》一文，据川岛说，此文是针对鲁迅，在文中，周暗示鲁迅是个“无赖子”。
舒芜在《周作人对鲁迅的影射攻击》一文中说：“周作人在公开发表的文字中，对鲁迅的人身攻击却是时时处处，一触即发，常常是非常恶毒的。”
周作人对鲁迅和许广平的结合亦有微词，他说鲁迅好色、纳妾，晚年，他的日记中仍有“兄弟皆多妻”之语。
虽然失和，但兄弟二人却没有断了联系，他们都在《语丝》写文章；有共同的朋友，这些朋友经常在同一天先后拜访二人，周建人、川岛不止一次充当了二人沟通的桥梁。二人还一致对外，在女师大风潮、“三一八惨案”中，周作人在鲁迅起草的《关于女师大风潮的宣言》上签了字；在鲁迅与陈源的比战中，周作人毫不犹豫站在了长兄一边。
荆有麟回忆，二人失和后，还常在北大教员休息室见面，一接触便起争执。可一旦有人攻击周作人，鲁迅便用各种笔名代弟弟应战。成仿吾和鲁迅论战时，周作人也在其文章中为鲁迅帮腔。“三一八惨案”发生后，鲁迅被列入北洋政府的缉捕名单，周作人知道后，马上托人通知鲁迅。
周作人的《五十自寿诗》发表后，友人们纷纷唱和，引发一场风波。鲁迅却能理解二弟，他在给杨霁云的信中说：“周作人之诗，其实是还藏些对于现状的不平的，但太隐晦，已为一般读者所不憭……”许多年后，周作人谈及鲁迅对他的上述评价时说：“当时胡风辈闹得满城风雨，独他一个人在答曹聚仁杨霁云的书简中，能够主持公论，胸中没有丝毫芥蒂，这不是寻常人所能做到的了。”
1936年10月19日清晨，鲁迅逝世。第二日，周作人恰好有一堂《六朝散文》课，他没有请假，而是挟着一本《颜氏家训》缓缓走进教室。在长达一个小时的时间里，周作人始终在讲颜之推的《兄弟》篇，只字未提其他事情。第一堂课下课前几分钟，周挥一挥袖子，掸了掸粉笔灰说：“对不起，下一堂课我不讲了，我要到鲁迅的老太太那里去。”这个时候，大家发现周的脸色非常难看。柳存仁回忆：“他并没有哭，也没有流泪，可是眼圈有点红热，脸上青白的一层面色，好像化上了一块硬铅似的。这一点钟的时间，真是一分钟一秒钟的慢慢的挨过，没有一个上课的人不是望着他的脸，安静地听讲的。这个时候容易叫你想起魏晋之间的阮籍丧母的故事。”
新中国成立后，周作人写了《鲁迅的故家》、《鲁迅小说里的人物》等作品，在谈及鲁迅时，也会称“家兄”。陈迩冬回忆，他在周作人屋中见到过鲁迅拓的汉碑，一次，周送他出门时，指着外院的丁香树说：“这是家兄种的。”
1958年，周作人在给曹聚仁的信中，谈及上海鲁迅墓前的塑像说：“死后随人摆布，说是纪念其实有些实是戏弄，我从照片看见上海坟头所设塑像，那实在可以真是最大的侮弄，高坐在椅上的人岂非是头戴纸冠之形象乎？假使陈西滢辈画这样一张相，作为讽刺，也很适当了。”
徐淦回忆，他在与周作人日常闲谈中常提到鲁迅，“知堂很坦率，从他的口吻中，我听出他对杰出的兄长之爱和敬，始终如一，像两人儿时、少时、青壮年、中年时的莫逆有增无减”。羽太信子一次给徐送茶时，也提到鲁迅，周作人当时翻译信子的话说：“内人告诉足下，自从足下来后，院子里的左邻右舍，都对她说，她们觉得又像过去大先生住在这里的时候，看到通宵在灯下干夜活的情形了，她们对大先生都是很敬爱、挺怀念的。”
对于长兄，周作人《在知堂回想录》中说：“我很自幸能够不俗，对于鲁迅研究供给了两种资料，也可以说对得起他了。关于鲁迅以外的人我只有对许季茀一个人，有要订正的地方，如上边所说的，至于其他无论什么样人要怎么说，便全由他们说去好了。”言下之意，当年他有对不起鲁迅之处。
周建人说，鲁迅逝世前几天，身边还放着周作人的书，闲来时常翻阅。而1966年7月2日，周作人开始阅读鲁迅的杂文。这对兄弟在即将离世之际，都不约而同阅读对方的文章，实在让人感慨万千。
周作人不仅与长兄鲁迅失和，与三弟周建人的关系亦不睦。
据周海婴记载，羽太信子怀孕后，其妹妹芳子从日本到绍兴照顾信子。信子得到芳子无微不至的照顾后，渐渐离不开芳子了。为了把芳子长久留在身边，她便准备撮合芳子和小叔周建人。周建人时正因青梅竹马的表妹病逝而十分悲痛。信子便乘机灌醉了周建人，将芳子推进周建人的房间。鲁迅谈及三弟的婚姻时，说是“逼迫加诈骗成局”。
据俞芳记载，在绍兴时，周建人与芳子关系尚好。周家迁到北京后，芳子看到姐姐大肆挥霍，十分羡慕，对信子言听计从，效仿信子，贪图享乐，常埋怨丈夫无能，不会赚钱。一次，周作人夫妇、芳子带着孩子去游玩，周建人准备同往，没想到，他走到车子旁边时，芳子一脸不屑地说：“你也去吗？”周建人看着妻子冰冷的表情，十分难受。
周建人到上海后，希望妻儿也一同到上海居住。但信子不让妹妹离开，芳子也不愿离开，反而经常写信向周建人要钱。后来，周建人积劳成疾，患了肺结核，芳子仍拒绝到上海照顾丈夫。五年后，心灰意冷的周建人与王蕴如结合。
鲁迅去世的1936年冬天，鲁老太太八十寿辰，周建人、王蕴如到北京为母亲祝寿。结果，信子、芳子大闹寿宴，周建人与芳子的长子周丰二更是手持军刀从屋内冲出，要砍周建人，被亲友拦下。此后，周丰二打电话到日本领事馆，要求他们扣留周建人，将其“法办”。周、王二人无奈，只能提前回到上海。鲁老太太伤心地对俞芳说：“如果大先生还在，八道湾不敢如此嚣张……”
抗战爆发前，冯雪峰认为，要让周作人�